來自丹麥科技大學生物技術與生物醫學系的研究人員，利用evosep one(30SPD)設備聯合Thermo Q‐Exactive HF‐X質譜一天就可完成了在TMT技術當中分餾混合的28個組分中GSH蛋白質組學鑒定，而傳統方法則可能需要兩天或者更長的時間，大大節約了科研寶貴的時間，鑒定結果重復性高。

　　1、題目

　　Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis

　　2、出處

　　Biotechnology & Bioengineering 雜志(IF：4.530)

　　3、研究機構

　　丹麥科技大學生物技術與生物醫學系等。

　　4、研究背景與目的

　　谷胱甘肽(GSH)在維持哺乳動物細胞氧化還原平衡中起著核心作用。以往對CHO細胞系的研究表明谷胱甘肽代謝與無性系生產能力有關。然而，需要一個深入的研究來理解這種關系，并潛在地突出細胞工程的新目標。在該研究中，通過調節CHO細胞生長代謝過程中谷胱甘肽的含量，具體為改變半胱氨酸在培養基的組成，以及使用丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)直接抑制GCL酶，以進一步闡明谷胱甘肽合成途徑的作用。

　　5、研究方法

　　本文通過改變培養基中半胱氨酸的組成，以及使用丁硫氨酸亞砜亞胺(BSO)直接抑制GCL酶兩種方法調節細胞內谷胱甘肽水平，進行了氨基酸測定，谷胱甘肽的測定，研究了細胞表型，測量了參與中心碳代謝的代謝產物，并采用TMT技術結合evosep one(30 SPD)和Thermo Q‐Exactive HF‐X進行了蛋白質組學分析。使用Proteome Discoverer (Thermo Fisher Scientific, 2.2版)的TMT報告離子定量和MS Amanda識別算法(Dorfer et al.，2014)對質譜進行處理。MS/ MS數據根據UniProtKB 提供的CHO K1蛋白質組和Global proteome Machine網站提供的污染物公共外源蛋白庫進行查詢。

　　6、研究結果

　　圖1 BSO處理對細胞生長、生產力和谷胱甘肽含量的影響

       灰色和藍色分別表示對照和低半胱氨酸培養基。圓圈表示未處理的生物反應器，三角形表示經過BSO處理的生物反應器。紅色虛線表示BSO加入0.5 mM培養基濃度的時間。(a)活細胞濃度(VCC)剖面。(b)上清液中隨時間變化的產物滴度。(c)細胞內谷胱甘肽濃度隨時間變化。(d)隨著時間的推移，mAb特定的生產力。

　　結果表明，在BSO添加后的第3天，CHO細胞系的表型不受GSH消耗的影響。從第6天開始，其生長速率逐漸降低，細胞體積逐漸增大，直到第10天。隨著時間的推移，總谷胱甘肽的增加和特定生產力的增加之間存在相關性。除產品效價外，兩種處理在生長曲線、蛋白質組學數據、代謝物攝取和生產速率方面均無顯著差異。

　　圖2 BSO處理對葡萄糖、乳酸和丙氨酸攝取/分泌率的影響

       灰色和藍色分別表示對照培養基或低半胱氨酸培養基。圓圈表示未處理的生物反應器，三角形表示經過BSO處理的生物反應器。紅色虛線表示BSO加入0.5 mM中濃度時的時間。

　　為了進一步表征GSH的消耗對CHO細胞系代謝的影響，測量了選定代謝物的每日細胞外濃度，并計算了相關的特定攝取和產生速率。乳酸由BSO處理的細胞產生，并被未處理的細胞消耗。在氨基酸攝取/分泌率方面，丙氨酸是唯一一個在BSO處理中與乳酸表現出相似特性的氨基酸。由于乳酸和丙氨酸可以從丙酮酸中產生，這些特征表明三羧酸(TCA)循環的失敗或減緩。

圖3 BSO處理下CHO細胞中差異表達蛋白的熱圖

　　表1 BSO處理細胞中膽固醇和三羧酸循環相關蛋白的表達

　　圖4 BSO處理細胞中谷胱甘肽代謝相關蛋白的表達

　　分別在第6天和第10天抽取50′106個細胞，使用TMT標記進行蛋白質組學分析。共63個蛋白對BSO反應有差異表達，其中下調蛋白47個，上調蛋白16個。與產品效價和細胞內谷胱甘肽含量相比，低半胱氨酸培養基處理不影響整體蛋白表達。在第一個聚類中，對照組的蛋白表達在第6天至第10天顯著增加，而BSO條件下的蛋白表達在第10天仍然很低。在BSO處理后的第6天和第10天最大的蛋白質簇下調，這具體包括膽固醇的生物合成、羧酸代謝和線粒體中氨基?；鵷 RNA的生物合成。所有參與膽固醇生物合成的酶均被下調，相關轉錄因子SREBP2也被下調，與TCA循環相關的線粒體蛋白下調。在最后一組(圖3)中，觀察到了對氧化應激的反應，因為這一組包含了大部分BSO上調的蛋白，包括三個與血紅素代謝相關的蛋白。在最后描述的兩個聚類中可以找到特異性參與GSH代謝的蛋白質。圖4顯示了檢測到的與GSH相關的蛋白質的更多細節，GSH合成相關蛋白總體上調，尤其是谷氨酸半胱氨酸連接酶調節亞基和S甲酰GSH水解酶。相比之下，一些參與谷胱甘肽消耗的蛋白質，例如用于谷胱甘肽解毒或分解代謝的蛋白質，總體上被下調。

　　7、研究結論

　　隨著生物過程的推移，細胞內谷胱甘肽和效價之間具有相關性。對BSO處理細胞和未處理細胞之間代謝物攝取/分泌率的分析和蛋白質組的比較表明，三羧酸循環的減緩導致了細胞外環境中乳酸和丙氨酸的分泌。此外，GSH相關蛋白質組的改變與谷氨酸半胱氨酸連接酶調節亞基的上調和特定的谷胱甘肽轉移酶Mu家族的下調相適應。本研究揭示了BSO對谷胱甘肽的調節也影響了脂類的生物合成，特別是在蛋白質分泌中起作用的膽固醇。

　　參考文獻

　　Chevallier V, Schoof E M, Malphettes L, et al. Characterization of glutathione proteome in CHO cells and its relationship with productivity and cholesterol synthesis[J]. Biotechnology and bioengineering, 2020, 117(11): 3448-3458.