Addgene是一個非盈利性全球質粒共享信息庫，它負責保存和提供質粒。今天給大家分享的內容是關于Addgene為什么要放棄qPCR定量AAV，相反選擇精準定量技術數字PCR(digital PCR，dPCR)。

自從Addgene開始制備腺相關病毒AAV載體以來，一直在使用qPCR來評估AAV載體的物理滴度，但是該方法需要做大量的重復實驗才能證實qPCR定量AAV載體的準確性，甚至作者認為可能需要重復10000次才能實現qPCR定量AAV的準確性，所以Addgene選擇使用更精準的dPCR定量方法。

一、qPCR技術定量AAV物理滴度

在深入研究dPCR之前，Addgene很長一段時間都在使用qPCR定量AAV。qPCR定量AAV時，對病毒DNA進行實時擴增和監控，當PCR完成后通過病毒DNA的閾值熒光和標準品的閾值熒光來分析結果。所以利用qPCR定量AAV需要一個已知病毒滴度的標準品AAV作為參考品，來評估未知樣本AAV的病毒滴度。

當然了，如果qPCR可以完美地解決AAV定量問題，在這里就不需要使用dPCR方法來定量AAV了。qPCR的一個問題是，針對同一個樣本檢測結果很可能差2倍，這意味著，如果你用同樣的樣本建立兩個相同的檢測方法，最終效價可能是4x10¹² GC/mL 或8x10¹² GC/mL，這兩個結果都是有效的。這就是為什么AAV參考品的選擇是至關重要的，它可以幫您確定您的滴定度是否在預期范圍內。

另外，我們發現，為qPCR繪制一條準確的標準曲線是非常有挑戰的。一方便質粒本身有超螺旋、線性和開環狀態，其定量結果各有差異，所以Addgene選擇使用了相對準確的線性化質粒作為標準品。然而，即使標準品是準確的，它仍然是不穩定的，所以未知樣本的檢測仍然是不具有高的重復性和準確性。

qPCR定量AAV面臨的挑戰：

需要標準品才能實現定量，并且準確的標準品的選擇具有很大挑戰;

繪制一條準確的標準曲線具有很大挑戰，且浪費人力;

qPCR定量AAV批次間的誤差較大，重復性不好;

然而數字PCR不需要標準品或參考品，這意味著節省了客戶大量時間，并且還可以獲得很高的數據重復性和準確性。

Figure 1：qPCR定量AAV需要標準品(橘黃色)、NTC(紫色)、參考品(粉紅色)，并且每個稀釋都需要做重復。dPCR定量AAV只需要一個NTC(紫色)，不需要標準品(橘黃色)和參考品(粉紅色)，

二、dPCR技術定量AAV物理滴度

數字PCR技術被譽為第三代PCR技術，可以在不需要標準品的情況下通過數數的方法實現核酸的絕對定量，具有數據穩定性高、重復性好、靈敏度高等特點。數字PCR是將PCR反應液通過數字PCR儀器自動分割成數萬個微反應，分割后有些微反應含有DNA模板(記作“1”)，有些微反應分區不含有目標DNA(記作“0”)，PCR擴增后熒光信號積累，通過數陽性信號的方法，便可以知道核酸的拷貝數。在試劑情況中，數字PCR的“數數”是利用泊松分布統計計算出的核酸的絕對拷貝數，大量實驗證實該方法的準確性和穩定性。

用dPCR滴定AAV的過程是從稀釋病毒開始的。值得注意的是，dPCR的動態范圍是每個反應1到100,000個基因組拷貝(GC)。由于AAV的效價一般在10¹²到10¹³ GC/mL 之間，所以在將樣品添加到混合反應也中之前，必須先對病毒進行連續稀釋。在Addgene，我們通常在dPCR 板上裝3份稀釋液。由于滴度是未知的，每個稀釋應在一個廣泛的滴度測定范圍內。

稀釋后，將檢測樣本被轉移到一個新的含有混合反應液，其中包括引物、探針和dPCR反應酶，buffer 混合液。

使用數字PCR儀器將反應混合液自動分割成10,000-20,000個微反應分區，然后進行PCR擴增，當 PCR 完成后，利用數字PCR閱讀器檢測每個微反應的熒光強度，發出熒光的微反應單元(1納升左右)包含著被放大的目標序列。在讀取所有微反應之后，軟件輸出樣本熒光圖片(圖2)。一個干凈的dPCR應該有一個明確的分離之間的陽性(綠色)和陰性(灰色)微滴。無模板陰性對照應該沒有陽性信號。

三、dPCR定量AAV的優勢

1. dPCR定量AAV解決了AAV產品批次誤差的問題，可以保證批次間cv<10%.

2. dPCR不需要標準品，定量AAV具有更高的數據重復性和準確性。

3.至少完成200個AAV樣本/天

四、ClarityTM 數字PCR系統

利用毛細虹吸原理將混有目標核酸的PCR反應混合液，均勻且獨立的分散到8聯管芯片中實現分區，接著進行芯片封閉，其后放入普通PCR儀器擴增，擴增后將八聯管芯片移至檢測系統中，進行芯片的圖像收集和目的核酸的絕對定量計算。

Clarity^TM digital PCR system

Clarity^TM 數字PCR芯片分區原理：Clarity數字PCR采用毛細管組成的芯片實現樣本自動分區，主要借助毛細管虹吸原理實現分區，每個分區大小一致，分區結果穩定，數據重復性好。

Clarity^TM數字PCR優勢

快速：96個反應完成時間<4h

準確：無交叉誤差，結果更準確;

開放：與大部分PCR儀和試劑兼容;

可回收：簡單震蕩便可回收產物;

高通量：8h可完成近200個反應;

分區穩定：采用管中芯片技術，分區更穩定;

操作簡單：無需專業人員操作;

參考文獻：

1. Furuta-Hanawa, Birei, Teruhide Yamaguchi, and Eriko Uchida. "2D droplet digital PCR as a tool for titration and integrity evaluation of recombinant adeno-associated viral vectors." Human Gene Therapy ja (2019). PubMed PMID: 31140327. PubMed Central PMCID: PMC6707039.

2. Gobert, Guillaume, et al. "Droplet digital PCR improves absolute quantification of viable lactic acid bacteria in faecal samples." Journal of microbiological methods 148 (2018): 64-73. PubMed PMID: 29548643.

3. Lock, Martin, et al. "Absolute determination of single-stranded and self-complementary adeno-associated viral vector genome titers by droplet digital PCR." Human gene therapy methods 25.2 (2013): 115-125. PubMed PMID: 24328707. PubMed Central PMCID: PMC3991984.

4. Song, Neng, et al. "Detection of circulating Mycobacterium tuberculosis-specific DNA by droplet digital PCR for vaccine evaluation in challenged monkeys and TB diagnosis." Emerging microbes & infections 7.1 (2018): 1-9. PubMed PMID: 29691363. PubMed Central PMCID: PMC5915492.