Addgene是一個非盈利性全球質粒共享信息庫,它負責保存和提供質粒。今天給大家分享的內容是關于Addgene為什么要放棄qPCR定量AAV,相反選擇精準定量技術數字PCR(digital PCR,dPCR)。
自從Addgene開始制備腺相關病毒AAV載體以來,一直在使用qPCR來評估AAV載體的物理滴度,但是該方法需要做大量的重復實驗才能證實qPCR定量AAV載體的準確性,甚至作者認為可能需要重復10000次才能實現qPCR定量AAV的準確性,所以Addgene選擇使用更精準的dPCR定量方法。
一、qPCR技術定量AAV物理滴度
在深入研究dPCR之前,Addgene很長一段時間都在使用qPCR定量AAV。qPCR定量AAV時,對病毒DNA進行實時擴增和監控,當PCR完成后通過病毒DNA的閾值熒光和標準品的閾值熒光來分析結果。所以利用qPCR定量AAV需要一個已知病毒滴度的標準品AAV作為參考品,來評估未知樣本AAV的病毒滴度。
當然了,如果qPCR可以完美地解決AAV定量問題,在這里就不需要使用dPCR方法來定量AAV了。qPCR的一個問題是,針對同一個樣本檢測結果很可能差2倍,這意味著,如果你用同樣的樣本建立兩個相同的檢測方法,最終效價可能是4x1012 GC/mL 或8x1012 GC/mL,這兩個結果都是有效的。這就是為什么AAV參考品的選擇是至關重要的,它可以幫您確定您的滴定度是否在預期范圍內。
另外,我們發現,為qPCR繪制一條準確的標準曲線是非常有挑戰的。一方便質粒本身有超螺旋、線性和開環狀態,其定量結果各有差異,所以Addgene選擇使用了相對準確的線性化質粒作為標準品。然而,即使標準品是準確的,它仍然是不穩定的,所以未知樣本的檢測仍然是不具有高的重復性和準確性。
qPCR定量AAV面臨的挑戰:
需要標準品才能實現定量,并且準確的標準品的選擇具有很大挑戰;
繪制一條準確的標準曲線具有很大挑戰,且浪費人力;
qPCR定量AAV批次間的誤差較大,重復性不好;
然而數字PCR不需要標準品或參考品,這意味著節省了客戶大量時間,并且還可以獲得很高的數據重復性和準確性。
Figure 1:qPCR定量AAV需要標準品(橘黃色)、NTC(紫色)、參考品(粉紅色),并且每個稀釋都需要做重復。dPCR定量AAV只需要一個NTC(紫色),不需要標準品(橘黃色)和參考品(粉紅色),
二、dPCR技術定量AAV物理滴度
數字PCR技術被譽為第三代PCR技術,可以在不需要標準品的情況下通過數數的方法實現核酸的絕對定量,具有數據穩定性高、重復性好、靈敏度高等特點。數字PCR是將PCR反應液通過數字PCR儀器自動分割成數萬個微反應,分割后有些微反應含有DNA模板(記作“1”),有些微反應分區不含有目標DNA(記作“0”),PCR擴增后熒光信號積累,通過數陽性信號的方法,便可以知道核酸的拷貝數。在試劑情況中,數字PCR的“數數”是利用泊松分布統計計算出的核酸的絕對拷貝數,大量實驗證實該方法的準確性和穩定性。
用dPCR滴定AAV的過程是從稀釋病毒開始的。值得注意的是,dPCR的動態范圍是每個反應1到100,000個基因組拷貝(GC)。由于AAV的效價一般在1012到1013 GC/mL 之間,所以在將樣品添加到混合反應也中之前,必須先對病毒進行連續稀釋。在Addgene,我們通常在dPCR 板上裝3份稀釋液。由于滴度是未知的,每個稀釋應在一個廣泛的滴度測定范圍內。
稀釋后,將檢測樣本被轉移到一個新的含有混合反應液,其中包括引物、探針和dPCR反應酶,buffer 混合液。
使用數字PCR儀器將反應混合液自動分割成10,000-20,000個微反應分區,然后進行PCR擴增,當 PCR 完成后,利用數字PCR閱讀器檢測每個微反應的熒光強度,發出熒光的微反應單元(1納升左右)包含著被放大的目標序列。在讀取所有微反應之后,軟件輸出樣本熒光圖片(圖2)。一個干凈的dPCR應該有一個明確的分離之間的陽性(綠色)和陰性(灰色)微滴。無模板陰性對照應該沒有陽性信號。
三、dPCR定量AAV的優勢
1. dPCR定量AAV解決了AAV產品批次誤差的問題,可以保證批次間cv<10%.
2. dPCR不需要標準品,定量AAV具有更高的數據重復性和準確性。
3.至少完成200個AAV樣本/天
四、ClarityTM 數字PCR系統
利用毛細虹吸原理將混有目標核酸的PCR反應混合液,均勻且獨立的分散到8聯管芯片中實現分區,接著進行芯片封閉,其后放入普通PCR儀器擴增,擴增后將八聯管芯片移至檢測系統中,進行芯片的圖像收集和目的核酸的絕對定量計算。
ClarityTM digital PCR system
ClarityTM數字PCR實驗流程
ClarityTM 數字PCR芯片分區原理:Clarity數字PCR采用毛細管組成的芯片實現樣本自動分區,主要借助毛細管虹吸原理實現分區,每個分區大小一致,分區結果穩定,數據重復性好。
ClarityTM數字PCR優勢
快速:96個反應完成時間<4h
準確:無交叉誤差,結果更準確;
開放:與大部分PCR儀和試劑兼容;
可回收:簡單震蕩便可回收產物;
高通量:8h可完成近200個反應;
分區穩定:采用管中芯片技術,分區更穩定;
操作簡單:無需專業人員操作;
參考文獻:
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